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ペルシア王ダーレイオスは、イオーニアの反乱にギリシアのアテーナイとエレトリアが加担したことを口実に、ギリシア本土に攻め込むことを決意しました。のちに第一次ペルシア戦争と呼ばれるこの時のペルシア軍の侵攻にはミュティレーネーの海軍も従軍を命じられたと想像します。しかしペルシアの陸軍はアテーナイ近くのマラトーンの平野での戦い(BC490年)でアテーナイ軍を中心とするギリシア軍によって撃退され、海軍の出番がないままペルシア軍はペルシア本土に撤退しました。ダーレイオス王はその雪辱を晴らすために再度の侵攻を準備していたのですが、準備中に死去し、息子のクセルクセースが王位を継ぎました。
クセルクセースは父王のうらみを晴らすために１回目の時より大規模な軍勢を編成し、王自らが出陣するという体制で、２回目のギリシア本土侵攻を実行に移しました(BC480年。第二次ペルシア戦争)。しかしアテーナイに近い島サラミースの近くで行われた海戦で、今度はアテーナイを中心とする海軍のために敗北を喫します。この時もミュティレーネーの海軍も参加していたのではないかと思うのですが、ヘーロドトスの記述には登場しません。サラミースの海戦の惨敗に慌てふためいたクセルクセース王は早々にギリシア本土をあとにしてペルシアに撤退します。彼はペルシアの将軍マルドニオスに陸軍を与え、あとを託します。一方、海軍のほうはサモス島まで撤退します。
一方クセルクセスの水軍の残存部隊は、サラミスから脱出してアジアに達し、王とその軍勢をケルソネソスからアビュドスに渡らせた後、キュメで冬を過した。春の萌しとともにサモスに集結したが、ここには艦隊の一部が冬営していた。（中略）何分はなはだしい打撃を蒙った後であるので、それ以上西へ向うことはせず、それを強制するものもないままサモスに居坐り、イオニア船を加えて合計三百隻の陣容をもって、イオニアが反乱を起さぬように警備していた。
ヘロドトス著「歴史」巻８、１３０ から
一方、ギリシア側の海軍はといいますと、これはスパルタ王レオーテュキデースが司令官となっていましたが、デーロス島までは進出したものの、その先は地理に不慣れでもあり、また敵艦船が充満しているようにも思えて、そこから東に進むことが出来ずにいました。ミュティレーネーは、サモスのペルシア海軍を恐れて表面上はペルシアに忠誠を誓っていました。しかし裏では策動があったようです。
ギリシア北部のテッサリアで冬を越したマルドニオスとその軍隊は翌BC479年、南下してアテーナイを再度目指しました。その頃、デーロス島のギリシア海軍の許に３名のサモス人がひそかに訪れて、スパルタ王レオーテュキデースに、サモスに来航してペルシアと戦って欲しい、と要請しました。そうすれば全イオーニアがペルシアに対して反乱するだろう、というのです。そこでレオーテュキデースが艦船をサモスに進めると、ペルシア側はかなわぬと判断してサモスの対岸にある小アジアのミュカレーまで撤退し、そこのペルシア陸軍と合流することにしました。これを機にギリシア側はミュカレーに上陸し、ペルシア軍に襲い掛かりました。すると今までペルシア側についていたギリシアの諸都市はペルシアに対して反乱し、ミュカレーの戦いはギリシア側の勝利になりました。この時にミュティレーネーもギリシア側に立って参戦しました。
さて不思議な偶然なのですが、ミュカレーの戦いと同じ日に遠く離れたプラタイアではスパルタの将軍パウサニアースが率いるギリシア諸都市の連合軍がマルドニオスのペルシア軍を破っています。この日をもってペルシアのギリシア侵攻の目論見は完全についえたのでした。
ミュティレーネーを含むギリシア諸都市は、ミュカレーの戦いに勝利を得たギリシア海軍がサモスに戻った時にその軍事同盟に正式に参加しました。それはギリシア本土の保護がなければペルシアから報復を受ける恐れが強かったからです。
かくしてサモス、キオス、レスボスをはじめギリシア軍に加わって参戦していたその他の島の住民を、忠誠を守って決して叛かぬと確約誓言させた上で同盟国に加えた。
ヘロドトス著「歴史」巻９、１０６ から
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